复旦大学王永明课题组开发出精准性高的Cas9基因编辑工具

发布时间:2023-02-03浏览次数:2327

复旦大学王永明课题组开发出精准性高的Cas9基因编辑工具


RNA引导的CRISPR-Cas9系统被广泛应用于哺乳动物细胞的基因组编辑,在基因遗传病的治疗中展现出巨大的发展潜力。限制基因编辑工具应用的主要因素包括编辑活性、PAM限制、蛋白大小、特异性问题等。识别NGG PAMSpCas9编辑活性高,是最常用的基因编辑工具。但SpCas9特异性较差,使用时往往伴随大量的有害突变。且当SpCas9用于基因治疗时,SpCas9太大无法被单个AAV递送。SaCas9虽然可以被单个AAV递送,但是向位点受复杂NNGRRT PAM的限制,编辑范围小。因此,为了实现基因治疗目的,可被单个AAV包装且更加全面的CRISPR/Cas系统的开发成为基因编辑领域亟待解决的重要问题。

1. Cas9活性鉴定思路


复旦大学王永明课题组致力于开发新型CRISPR/Cas9系统,扩大基因编辑范围。为此设计了Cas9蛋白的鉴定新思路,将基因编辑和GFP表达偶联,实现对CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中的快速筛选(1)。团队先后对300多个Cas9进行鉴定,开发出一系列性能优异的核酸工具酶。该课题组于20203月开发出SauriCas9,识别NNGG PAM,蛋白较小,可被单个AAV包装,扩大了基因编辑范围。20214月团队开发出SlugCas9-HF,蛋白小、特异性高,活性可以和SpCas9媲美。202112月,该课题组开发出SchCas9,识别更简单的NNGRR=A or GPAM,编辑范围得到进一步扩大。20228月,课题组开发出IICNsp2Cas9及其嵌合体核酸酶,识别N4C PAM,进一步大幅扩展了基因组编辑范围。

202323,王永明课题组又有新突破,在Molecular Therapy上在线发表了题为“Genome editing with natural and engineered CjCas9 orthologs的研究论文。

作者通过对CjCas9同源蛋白的筛选,鉴定到3种天然的基因编辑工具(Hsp1Cas9Hsp2Cas9CcuCas9),其PAM分别为N4RAAN4CCN4CNA,扩大了基因编辑应用范围(2)。

2.CjCas9同源编辑工具的鉴定


为获得综合性质更优的编辑工具,作者以活性较高的Hsp1Cas9为骨架,与Hsp2Cas9PI结构域嵌合,获得识别PAMN4CN4THsp1-Hsp2Cas93)。

3. Hsp1-Hsp2Cas9嵌合体编辑工具的开发


作者根据CjCas9晶体结构信息进行合理设计,得到了Hsp1-Hsp2Cas9-Y突变体,在不降低编辑活性的同时提高了精确性,为临床基因治疗应用提供了更加安全的编辑工具(4)

4. Hsp1-Hsp2Cas9-Y的特异性分析


高思琪、王瑶、齐涛为论文的共同一作,复旦大学王永明、孙淑娜、华林中心的刘慧慧是论文的共同通讯作者。

论文DOI: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.01.029