核酸快速检测对于临床诊断和生物技术应用不可或缺。最近，基于CRISPR系统的基因编辑技术也被应用于基因检测。借助于Cas13a和Cas12a的附带切割活性开发的SHERLOCK系统，DETECTR系统和HOLMES系统实现了针对病原体和肿瘤基因的精准检测。但是，在这些检测系统中通常将核酸扩增和检测步骤分开，开盖操作极易造成扩增子气溶胶污染，产生 “假阳性”结果。此外，目前的CRISPR检测技术需要借助荧光设备，并且至少需要一个小时才能完成，不适用于低成本的核酸现场快速检测。
针对这一问题，王永明团队探索了重组聚合酶扩增和Cas12a切割兼容的体系，并且开发了Cas12aVDet (Cas12a-based Visual Detection)可视化检测方法，首次将核酸扩增和检测体系置于同一反应管中，反应完成后在蓝光激发下直接通过肉眼观察结果，整个过程可在30 min内完成。该方法操作简便，检测快速，检测结果肉眼可见，检测灵敏度达到单分子水平。相关成果于2019年8月28日以“Cas12aVDet: a CRISPR/Cas12a-based platform forrapid and visual nucleic acid detection”为题在线发表在美国化学会《American Chemical Society》旗下主要期刊《分析化学》（Analytical Chemistry）上。
图1 Cas12aVDet可视化核酸快速检测方法原理图
如上图所示，该方法首先将RPA扩增试剂和除Cas12a酶外的Cas12a切割体系试剂混匀后置于管内，Cas12a酶置于管壁。然后，在37℃条件下反应15min进行RPA扩增。随后，将Cas12a酶离心到反应液中在37℃条件下继续反应15min进行Cas12a切割。最后，在蓝光灯激发下通过肉眼观察检测结果，阳性样本将呈现出明亮的绿色荧光，阴性样本无荧光产生。研究发现，Cas12aVDet方法可实现对核酸的快速检测，检测灵敏度可达到单分子水平。该方法成本低廉，操作简便，在疾病诊断、致病菌检测以及便携式检测设备开发中具有极大的应用潜力。
图2针对靶位点设计的特异性识别序列及其核酸荧光检测结果图
通过检测质粒上的靶位点对Cas12aVDet可视化检测体系进行评估。首先，针对靶位点分别设计crRNA1和crRNA2特异性识别序列（如图a所示）。接着，采用Cas12aVDet可视化检测体系进行检测，检测荧光值和可视化检测结果的对比数据如图b所示。结果显示阳性样本呈现出强烈的绿色荧光，可与阴性样本进行明显区分，检测结果可采用肉眼观察或手机拍照。
王永明课题组的硕士生王贝和浙江大学博士生王瑞为该论文的共同第一作者，王永明教授为该论文的通讯作者。
全文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.9b01526