N6-methyladenosine（m6A）是真核生物mRNA上含量最丰富的化学修饰之一，由甲基转移酶复合物（Writer）所添加，主要被含有YTH结构域的Reader识别，并且可以被FTO和ALKBH5等Eraser去除。m6A甲基转移酶复合物由进化中保守的7个成员构成，包括催化组分Mettl3，以及Mettl14, WTAP (Fl(2)d), VIRMA (Vir), RBM15 (Nito), ZC3H13 (Xio or Flacc)和Hakai，其中Hakai作为一个潜在的RING finger E3泛素连接酶是研究最少的。
严冬课题组前期筛选和鉴定了m6A甲基转移酶复合物和果蝇性别决定通路两个新的组分Nito（PNAS, 2015）和Xio（也称为Flacc）（PNAS, 2018），并参与了果蝇m6A修饰通路的整体解析。2021年4月12日，在Nature Communications杂志上发表题为“Role of Hakai in m6A modification pathway in Drosophila”的文章。本文是作者m6A甲基转移酶复合物研究三部曲之一，证明了Hakai是m6A 修饰通路核心成员之一，解析了它及其它成员的作用机制，并发现了性别特异性的m6A修饰方式。
首先，作者验证了Hakai与其他m6A writer组分存在相互作用，并且Hakai突变体果蝇表现出特征性的m6A通路表型，例如mRNA中的m6A修饰水平降低，Sxl（Sex lethal）及其它基因的可变剪接出现异常，成虫翅膀姿势异常和不能飞行，以及在MeRIP-seq实验中减少的m6A峰与Mettl3和Mettl14突变体相一致。这些数据清楚表明Hakai是保守的m6A甲基转移酶复合物的核心组分之一。
随后，作者对m6A writer多个组分的作用机理进行了较为系统的研究，发现Fl(2)d, Vir, Hakai和Flacc形成稳定的复合物，敲除Fl(2)d, Vir或Hakai导致其它三个组分的降解，但是Mettl3, Mettl14和Nito不受其影响。敲除Flacc导致Fl(2)d的细胞核染色减少，与之前细胞系中报导的结果相一致。基于这些结果，作者提出了m6A甲基转移酶复合物的工作模型（图1）。
图1. m6A甲基转移酶复合物
Hakai最初在人类细胞中被鉴定出来，它与钙粘蛋白(E-cadherin)相互结合并导致其泛素化，从而促进E-cadherin的内吞和降解。但是，作者使用多种遗传工具进行的体内分析未发现Hakai在E-cadherin调节中的作用。并且Hakai是一种普遍存在的核蛋白，几乎与膜上的E-cadherin没有共定位。因此，这一模型需要使用基因敲除小鼠进行进一步解析，此外还需要寻找Hakai作为潜在E3连接酶的底物。
通过在野生型成虫以及Mettl3，Mettl14和Hakai突变体中进行MeRIP-seq，发现尽管大多数m6A修饰峰分布在3'UTR中，但在m6A writer突变体中下降的峰则主要是位于5'UTR中。而在哺乳动物中，m6A峰则主要富集在3'UTR和终止密码子附近。3'UTR中的m6A修饰通常会导致mRNA的不稳定，而5'UTR中的m6A与翻译增强有关。作者没有观察到与野生型相比，Mettl3突变体中m6A靶标的mRNA半衰期增加，暗示m6A修饰在果蝇中的主要作用不是在mRNA降解上。
该文中最有趣的发现可能是展示了围绕Sxl关键外显子的雌性特异性m6A修饰。Sxl是教科书上关于可变剪接的经典范例：雄性剪接形式包含外显子3，该外显子含有终止密码子并导致Sxl蛋白翻译的早期终止；而雌性剪接形式则跳过外显子3并因此产生功能性的Sxl蛋白。最近，m6A修饰途径被证明调控Sxl的可变剪接，但是m6A修饰与Sxl蛋白协同调节其自身剪接的详细机制仍不清楚。作者MeRIP-seq数据显示，只有在雌性中，Sxl外显子3及其周围存在m6A修饰，并且位于Sxl结合位点附近（图2）。m6A-IP-qPCR进一步验证了这一发现，并表明这些修饰在Mettl3突变体雌性果蝇中下降。这一出乎意料的发现提示了一种模型，即Sxl的一个主要功能可能是招募m6A writer复合体从而甲基化附近的m6A位点。m6A reader Ythdc1然后结合到这些位点，并可能与剪接机器相互作用以抑制剪接。
图2. Sxl与m6A修饰共同调控其可变剪接的模型
严冬团队博士生王艳花、张立凤、任航为本文的共同第一作者（中国科学院分子植物科学卓越创新中心为第一单位），严冬研究员为通讯作者（复旦大学生命科学学院为通讯作者单位）。此工作得到了国家重点研发计划和国家自然科学基金的资助。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-22424-5
严冬课题组依托于复旦大学生命科学学院和遗传工程国家重点实验室，主要以果蝇和小鼠模型研究RNA表观修饰在动物发育和稳态维持中的功能和机理，欢迎有兴趣的博士后和硕博生加盟或咨询，请联系yandong@fudan.edu.cn。