小RNA介导的基因沉默是真核生物调控基因表达，维持基因组稳定以及抵抗外源遗传物质入侵的关键机制。小RNA测序（sRNA-seq）是高通量表征和分析各类小RNA的重要手段。但常规sRNA-seq中大量的测序数据（很多时候超过40%）来自结构型RNA（包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA）以及其它RNA的降解片段，不仅降低了目标sRNA的比例，还影响了实验的批次间可重复性，低质量的样本甚至导致文库构建失败。因此，常规sRNA-seq对于样品和建库技术的要求通常较高。此外，非sRNA位点测序片段的干扰加大了数据分析的复杂性，尤其是对具有复杂基因组/非模式生物中的sRNA鉴定与注释。
和动物不同，植物中各种类型小RNA（包括miRNA及各种siRNA）中的3’末端均携带高程度的2’核糖位甲基化修饰（2’-O-Me）。该修饰由小RNA甲基转移酶HEN1催化。HEN1缺失会引起小RNA 3’端尿苷化加尾和截短，表明2’-O-Me修饰对于维持小RNA 3’稳定性至关重要。因此，特异性对2’核糖位修饰的植物小RNA进行建库测序可以有效克服常规sRNA-seq带来的局限性。NaIO4氧化处理和PBA（phenylboronic acid, 3-丙烯酰胺基苯硼酸）变性凝胶电泳已被用于甲基化修饰小RNA的分析，但两种方法各自及组合效率尚未得到系统比较和评估。
近日，复旦大学任国栋课题组在Nucleic Acids Research杂志在线发表了题为“PBOX-sRNA-seq uncovers novel features of miRNA modification and identifies selected 5’-tRNA fragments bearing 2’-O-modification”的研究论文。该论文借助hen1-2弱突变体同时含有甲基化sRNA及非甲基化sRNA（可通过长度和非模板加尾进行区分）的特点，系统评估了PBA变性凝胶电泳分离（PBA-sRNA-seq）、NaIO4处理（OX-sRNA-seq）以及联合处理（PBOX-sRNA-seq）测序方法对末端修饰小RNA测序的影响，发现PBOX-sRNA-seq具有最高的信噪比。
PBOX-sRNA-seq数据中比对到已知类型小RNA的比例高达90% （对照sRNA-seq不到50%）。利用PBOX-sRNA-seq，研究人员可从严重降解的RNA样本（RIN=4.15）以及AGO-RIP样品中高效克隆出全长的miRNA和siRNA。对拟南芥hen1-2弱突变体进行分析发现，HEN1的部分缺失更容易引起miRNA甲基化水平的下降。与预期一致，大量截短和加尾的miRNA（被认为是非甲基化的miRNA）在PBOX-sRNA-seq中不能被克隆。然而，相较于长尿苷化加尾的几乎完全丧失，单尿苷/胞苷加尾却有显著滞留，表明这部分单尿苷/胞苷加尾的miRNA是携带甲基化修饰的。根据现有的文献，单尿苷/胞苷加尾有可能发生在pre-miRNA上，被Dicer加工后经HEN1甲基化而保留。然而，结合pri-miRNA加工方向分析，部分被单尿苷/胞苷修饰的miRNA在pre-miRNA阶段其3’末端仍嵌在其前体中，因此不可能在该阶段被加尾，而更有可能是在新生miRNA/miRNA*阶段加尾后再被HEN1甲基化。此外，PBOX-sRNA-seq还鉴定到来自tRNA 5’端的13-nt tRFAla-5a和26- nt tRFGly-5b携带有不依赖HEN1的2’-O修饰，并且在玉米、水稻、番茄等多个物种中保守。
综上，本研究系统评估并改良了现有的2’-O修饰小RNA的建库测序方法，在此基础上揭示了植物小RNA末端修饰的新特征。研究结果为深入理解小RNA修饰、代谢及在基因表达调控和生物学功能中的复杂作用提供了有力工具和重要线索。
复旦大学生命科学学院已毕业博士生陈素素（现为海军军医大学博士后）、在读博士生蔡宇晨和杨惠如为本文共同第一作者，任国栋研究员为通讯作者。该研究得到了上海市科委、上海市曙光计划及国家自然科学基金等项目资助。
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https://doi.org/10.1093/nar/gkae537