与动物不同，植物的生殖细胞起源于营养生长向生殖生长转变的过程中，某个特定的体细胞发生的细胞命运转变。模式植物拟南芥的雌配子发育起源于胚珠原基中大孢子母细胞(Megaspore mother cell, MMC)的形成。在胚珠的发育过程中，珠心顶端的一个亚表皮细胞发生细胞命运转变由体细胞转变为生殖细胞，该细胞的细胞大小以及细胞核大小迅速增大，随后进行一次减数分裂形成四个大孢子，其中，其中靠近合点端的细胞转变为功能性大孢子而其余三个细胞退化消失，功能性大孢子随后进行两轮有丝分裂，最终形成包含一个卵细胞，一个双核中央细胞，两个助细胞和三个反足细胞的七细胞八核的完整雌配子体（胚囊）。作为雌配子体形成的开端，MMC的形成至关重要。在大部分植物中，一个胚珠中只允许形成一个MMC。近年来研究发现植物激素和表观遗传途径紊乱均导致胚珠原多个MMC。本课题组前期研究发现拟南芥主要的DNA甲基转移酶MET1功能受阻也导致多个MMC产生，但全基因组范围内DNA甲基化在多大程度上以及如何参与MMC旁侧体细胞的命运决定的调控机制并不清楚。
2025年2月3日，郑丙莲课题组在The Plant Cell在线发表了题为“The DNA methylation–demethylation balance prevents development of multiple megaspore mother cells in Arabidopsis”的研究论文。该研究观察了拟南芥胚珠整个发育过程中不同细胞的DNA甲基化水平的时空变化，揭示了DNA甲基化水平的稳态维持是阻止周围体细胞向大孢子母细胞转变的前提条件。
为了探究DNA甲基化维持单个MMC的机制，本研究首先对拟南芥中已知的DNA甲基化以及去甲基化酶的突变体的胚珠进行了观察，发现三类DNA甲基化（mCG，mCHH, mCHG）以及去甲基化都参与保证单个MMC的维持，突变体中部分胚珠中出现MMC类似的异常细胞。随后，通过构建DNA甲基转移酶和去甲基化酶的双重突变体，或者对DNA去甲基化酶突变体用DNA甲基化转移酶的抑制剂处理，两种手段均使得突变体植物中的DNA甲基化水平重新达到平衡，结果发现回补植株中的MMC数目正常。这些表型观察的结果说明DNA甲基化的相对平衡而非绝对水平是维持单个MMC的重要前提。为了探究胚珠发育过程中DNA甲基化水平的细胞间分布情况，本研究利用指征mCHH水平的荧光报告系统详细比较了MMC和周围体细胞（最外层L1细胞、旁侧体细胞L2-f、下端体细胞L2-u）的不同发育阶段的CHH甲基化水平。结果发现MMC前体细胞的mCHH在胚珠原基细胞形态特征未出现分化之前就开始下降，早于广泛使用的MMC marker基因KNU的表达。在DNA甲基化酶与去甲基化酶突变体中，MMC的部分旁侧体细胞L2-f的mCHH也会下降到类似于MMC的极低水平。为了探究mCHH在MMC中降低的机制，本研究分析了所有DNA甲基转移酶和去甲基化酶的时空表达，结果发现从头DNA甲基转移酶DRM2的表达在MMC特化之前就降低，而DNA去甲基化酶DME则在MMC的marker KNU表达后开始降低。这些观察提示我们MMC旁侧体细胞L2-f中DRM2与DME的相对平衡可能是抑制这些体细胞转变成MMC的关键。为了验证该假设，我们在drm1/2突变体MMC旁侧体细胞L2-f中特异性回补DRM2或降低DME的表达水平，结果发现该遗传手段能有效地回补drm1/2中多个MMC形成的表型，说明MMC旁侧体细胞L2-f中DRM2与DME的平衡是维持其体细胞命运的关键。最后，本研究发现DNA甲基化稳态可能通过限制生殖细胞形成相关的先锋因子SPL/NZZ的表达位置保证每个胚珠中只形成一个MMC。综上，我们的结果揭示了DNA甲基化水平的平衡而不是绝对水平能保证胚珠只形成一个MMC。
图注：在胚珠发育早期，胚珠的表皮下细胞的mCHH相对水平没有明显差异。随着胚珠的发育，位于最顶端最中央的亚表皮细胞的mCHH水平开始下降，与周围体细胞出现明显差异。当MMC确定后其mCHH水平降低到几乎检测不到的水平。此时DNA甲基化失调的突变体中，部分邻近MMC的体细胞的mCHH水平下降到类似MMC的较低水平，随后可能发育成额外的MMC。DNA甲基化水平的相对平衡可能通过限制与生殖细胞形成相关的先锋因子SPL的表达位置保证一个胚珠中只形成一个MMC。
复旦大学生命科学学院郑丙莲教授课题组博士生蒋婷为本文第一作者，郑丙莲教授为通讯作者。北京大学北京国际数学研究中心张磊教授和中国科学院上海植物逆境生物学研究中心Daisuke Miki研究员参与了该研究工作。复旦大学博士后李磊，博士生胡倩倩也参与了该项工作。本研究得到了复旦大学遗传工程国家重点实验室、国家自然科学基金杰出青年基金和重点项目的资助。
文章链接：https://academic.oup.com/plcell/advance article/doi/10.1093/plcell/koaf023/7997483。